發(fā)布時(shí)間： 2024-07-30
多肽類藥物分子大小介于小分子化藥和大分子蛋白質(zhì)之間，因而具有小分子化藥及大分子蛋白質(zhì)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，比如比小分子化藥擁有更高的活性和選擇性，比大分子蛋白質(zhì)擁有更低的免疫原性及生產(chǎn)可及性。憑借這些獨(dú)特的藥理作用優(yōu)勢，加之日趨成熟的多肽合成技術(shù)，多肽類藥物已成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，具有廣闊的開發(fā)前景。
1 直接替換法
最直接的最簡單的方法是以質(zhì)譜兼容的酸或鹽替代三氟乙酸，可替換的酸（鹽）包括甲酸（甲酸銨）、乙酸（乙酸銨）、二氟乙酸、三氟丙酸等。
1）甲酸、乙酸及其可揮發(fā)性緩沖鹽
最常見的是以甲酸替代三氟乙酸。
例如在某重組GLP-1類似物的雜質(zhì)譜研究中，因三氟乙酸對儀器有損傷故而選擇甲酸替代三氟乙酸，結(jié)果獲得了較好的質(zhì)譜響應(yīng)（見圖1），結(jié)合MALDI高分辨質(zhì)譜以及氨基酸全序列測序的結(jié)果，對雜質(zhì)進(jìn)行了解析，確證了可能的氨基酸序列（圖2）。
除了酸也可以采用相應(yīng)的可揮發(fā)性鹽。
例如：在抗菌肽（cbf-14）的降解機(jī)理研究中，以甲酸銨緩沖液（pH3.0）為流動(dòng)相，測定了降解雜質(zhì)的分子量信息，根據(jù)分子量初步推測出其結(jié)構(gòu)（見圖3），并闡明了這些雜質(zhì)的來源和形成機(jī)制，為后續(xù)Cbf-14和其他多肽產(chǎn)品質(zhì)量研究提供參考。
2）二氟乙酸
以甲酸、乙酸及其相應(yīng)的可揮發(fā)性鹽替換三氟乙酸是最常見的行之有效的作法，但是在實(shí)際應(yīng)用過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)很多多肽在甲酸或甲酸銨等流動(dòng)相中峰型較差，分離度嚴(yán)重受損，并且那些對pH較為敏感的組分保留時(shí)間及出峰順序可能會(huì)發(fā)生難以預(yù)測的變化，影響雜質(zhì)指認(rèn)。這時(shí)可以考慮以二氟乙酸替換三氟乙酸（見圖4）。
二氟乙酸的酸強(qiáng)度較甲酸強(qiáng)，可以最大限度的確保出峰順序不發(fā)生變化，同時(shí)又可以獲得較好的色譜峰型和分離度，此外由于其疏水性較低，有利于影響電噴霧液滴的表面張力對質(zhì)譜信號沒有明顯的抑制作用，可以在盡量確保峰容量的情況下獲得較強(qiáng)的質(zhì)譜響應(yīng)。有學(xué)者采用8種不同的多肽組分，分別以0.1%甲酸、0.1%二氟乙酸及0.1%三氟乙酸為流動(dòng)相，對比其質(zhì)譜響應(yīng)，證實(shí)了二氟乙酸的質(zhì)譜響應(yīng)較三氟乙酸有明顯提升（見圖5）。
遺憾的是，目前這種試劑普遍還沒有色譜級或質(zhì)譜級規(guī)格產(chǎn)品，購買的產(chǎn)品中通常有較高濃度的鈉和鉀，可能會(huì)破壞質(zhì)譜的可解釋性，使用時(shí)需仔細(xì)評估其純度，必要時(shí)可蒸餾處理后使用。
2 二維色譜
除了上述直接替換的方法，還可以嘗試二維色譜法。二維色譜既可以原汁原味的保留多肽類藥物的有關(guān)物質(zhì)液相條件，同時(shí)又避免了質(zhì)譜兼容性差的問題。
二維色譜最初是用于解決多組分樣品在一維色譜難分離的問題的，近些年也逐漸被用于解決質(zhì)譜難兼容的雜質(zhì)研究問題，多肽類藥物的雜質(zhì)研究就是其中之一。通常第一維色譜采用有關(guān)物質(zhì)色譜條件，然后選擇待研究雜質(zhì)組分將其切入二維色譜中，二維色譜是與質(zhì)譜兼容的色譜條件，二維色譜通常采用簡單的通用大梯度或者等度，通過二維色譜將待測組分送入質(zhì)譜檢測器，測定其分子量。
例如某多肽類原研制劑CBTC，依據(jù)其進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)物質(zhì)方法的流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液，由于磷酸鹽是難揮發(fā)性鹽，因此與質(zhì)譜難兼容，在其雜質(zhì)研究中研發(fā)人員運(yùn)用二維液相色譜技術(shù)進(jìn)實(shí)現(xiàn)一級分離組分的快速脫鹽處理，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，最終對標(biāo)準(zhǔn)中提到的雜質(zhì)進(jìn)行了定性分析，并推測出其結(jié)構(gòu)，結(jié)果見下表（見表1）。
3 半制備
如果既無法找到適宜的替代添加劑也不具備二維色譜，還可以嘗試一種稍復(fù)雜的方法，就是從液相中接出待測組分，然后將其富集，再通過LC-MS測定其分子量。這種方式適合測定含量相對較高且與相鄰雜質(zhì)基線分離的雜質(zhì)。在某項(xiàng)目中，我們需要測定某多肽酸降解雜質(zhì)的分子量，有關(guān)物質(zhì)方法中使用的添加劑是三氟乙酸，當(dāng)時(shí)采用甲酸替換三氟乙酸導(dǎo)致分辨率極度下降且雜質(zhì)出峰順序似乎發(fā)生了變化，無法辨別哪個(gè)雜質(zhì)是酸降解雜質(zhì)，當(dāng)時(shí)也沒有二維色譜，于是先采用分析液相高濃度進(jìn)樣，然后接收酸降解雜質(zhì)的餾分，大體積注入質(zhì)譜儀中，最終獲得了該雜質(zhì)的分子量。
小結(jié)
多肽類藥物的雜質(zhì)研究是其質(zhì)量控制的重要組成，當(dāng)所開發(fā)的有關(guān)物質(zhì)檢測方法與質(zhì)譜難兼容時(shí)我們不妨試試上述幾種方法，不管是哪一種多肽，相信總有一種辦法適合你。
參考文獻(xiàn)
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